Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Sedangkan pengukuran menggunakan spektrofotometer ini, metoda yang digunakan sering disebut dengan spektrofotometri.
Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual dengan studi yang lebih mendalam dari absorbsi energi. Absorbsi radiasi oleh suatu sampel diukur pada berbagai panjang gelombangdan dialirkan oleh suatu perkam untuk menghasilkan spektrum tertentu yang khas untuk komponen yang berbeda.
Absorbsi sinar oleh larutan mengikuti hukum Lambert-Beer, yaitu :
A = log ( Io / It ) = a b c
Keterangan : Io = Intensitas sinar datang
It = Intensitas sinar yang diteruskan
a = Absorptivitas
b = Panjang sel/kuvet
c = konsentrasi (g/l)
A = Absorban
Spektrofotometri merupakan bagian dari fotometri dan dapat dibedakan dari filter fotometri sebagai berikut :
1. Daerah jangkauan spektrum
Filter fotometr hanya dapat digunakan untuk mengukur serapan sinar tampak (400-750 nm). Sedangkan spektrofotometer dapat mengukur serapan di daerah tampak, UV (200-380 nm) maupun IR (> 750 nm).
2. Sumber sinar
Sesuai dengan daerah jangkauan spektrumnya maka spektrofotometer menggunakan sumber sinar yang berbeda pada masing-masing daerah (sinar tampak, UV, IR). Sedangkan sumber sinar filter fotometer hanya untuk daerah tampak.
3. Monokromator
Filter fotometere menggunakan filter sebagai monokrmator. Tetapi pada spektro digunakan kisi atau prisma yang daya resolusinya lebih baik.
4. Detektor
- Filter fotometer menggunakan detektor fotosel
- Spektrofotometer menggunakan tabung penggandaan foton atau fototube.
Komponen utama dari spektrofotometer yaitu :
1. Sumber cahaya
Untuk radisi kontinue :
- Untuk daerah UV dan daerah tampak :
- Lampu wolfram (lampu pijar) menghasilkan spektrum kontiniu pada gelombang 320-2500 nm.
- Lampu hidrogen atau deutrium (160-375 nm)
- Lampu gas xenon (250-600 nm)
Untuk daerah IR
Ada tiga macam sumber sinar yang dapat digunakan :
- Lampu Nerst,dibuat dari campuran zirkonium oxida (38%) Itrium oxida (38%) dan erbiumoxida (3%)
- Lampu globar dibuat dari silisium Carbida (SiC).
- Lampu Nkrom terdiri dari pita nikel krom dengan panjang gelombang 0,4 – 20 nm
- Spektrum radiasi garis UV atau tampak :
- Lampu uap (lampu Natrium, Lampu Raksa)
- Lampu katoda cekung/lampu katoda berongga
- Lampu pembawa muatan dan elektroda (elektrodeless dhischarge lamp)
- Laser
2. Pengatur Intensitas
Berfungsi untuk mengatur intensitas sinar yang dihasilkan oleh sumber cahaya agar sinar yang masuk tetap konstan.
3. Monokromator
Berfungsi untuk merubah sinar polikromatis menjadi sinar monokromatis sesuai yang dibutuhkan oleh pengukuran
Macam-macam monokromator :
- Prisma
- kaca untuk daerah sinar tampak
- kuarsa untuk daerah UV
- Rock salt (kristal garam) untuk daerah IR
- Kisi difraksi
Keuntungan menggunakan kisi :
- Dispersi sinar merata
- Dispersi lebih baik dengan ukuran pendispersi yang sama
- Dapat digunakan dalam seluruh jangkauan spektrum
4. Kuvet
Pada pengukuran di daerah sinar tampak digunakan kuvet kaca dan daerah UV digunakan kuvet kuarsa serta kristal garam untuk daerah IR.
5. Detektor
Fungsinya untuk merubah sinar menjadi energi listrik yang sebanding dengan besaran yang dapat diukur.
Syarat-syarat ideal sebuah detektor :
- Kepekan yang tinggi
- Perbandingan isyarat atau signal dengan bising tinggi
- Respon konstan pada berbagai panjang gelombang.
- Waktu respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi.
- Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi.
Macam-macam detektor :
- Detektor foto (Photo detector)
- Photocell
- Phototube
- Hantaran foto
- Dioda foto
- Detektor panas
6. Penguat (amplifier)
Berfungsi untuk memperbesar arus yang dihasilkan oleh detektor agar dapat dibaca oleh indikator.
7. Indikator
Dapat berupa :
- Recorder
- Komputer
Pembahasan Praktikum Spektrofotometri
Pada percobaan yang pertama memiliki tujuan yaitu menentukan kadar gula reduksi. Pertama yang dilakukan adalah 0,1 mg/ml larutan glukosa standar yang tidak berwarna diencerkan dengan aquades hingga konsentrasi glukosa menjadi 2 mg/100 ml, 4 mg/100ml, 6 mg/100ml, 8 mg/100ml, dan 10 mg/100ml. Kemudian masing-masing larutan glukosa dengan konsentrasi tersebut dimasukkan dalam tabung reaksi yang berbeda-beda, dan pada tabung ke-6 diisi dengan aquades. Selanjutnya ditambahkan 1 ml reagen Nelson. Tampak perubahan warna setelah penambahan reagen Nelson pada masing-masing tabung yaitu warna larutan menjadi biru. Fungsi adanya reagen Nelson ini yaitu untuk mereduksi kupri oksida menjadi kupro oksida yang mana K-Na-tartrat yang ada dalam reagen Nelson berfungsi untuk mencegah terjadinya pengendapan kupri oksida sehingga nantinya kupri oksida bisa direduksi menjadi kupro oksida. Lalu larutan tersebut dipanaskan dalam air yang mendidih selama 20 menit. Hal ini bertujuan untuk mempercepat proses reduksi kupri oksida menjadi kupro oksida. Lalu larutan didinginkan supaya reaksi berjalan stabil karena jika terlalu panas kemungkinan akan ada komponen senyawa yang rusak atau habis karena menguap. Larutan berubah warna menjadi hijau setelah proses pemanasan tersebut. Setelah didinginkan maka larutan ditambahkan dengan reagen arsenomolybdat yang berwarna kuning kehijauan sebanyak 1mL. Penambahan larutan arsenomolybdat ini bertujuan agar bisa bereaksi dengan endapan kupro oksida. Pada peristiwa ini kupro oksida akan mereduksi kembali arsenomolybdat menjadi molibdene blue yang berwarna biru, warna biru inilah yang nantinya akan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer. Lalu ditambahkan dengan aquadest hingga 10 mL agar larutan tidak terlalu pekat dan dapat terbaca saat dilakukan pembacaan absorbansi. Setelah itu larutan dikocok agar larutan tercampur secara merata dan homogen.
Kemudian dilakukan pembacaan absorbansi pada panjang gelombang 540 nm karena pada panjang gelombang ini molekul glukosa dapat menyerap sinar secara optimum sehingga pembacaan absorbansi dapat berjalan dengan baik.
Langkah yang kedua adalah pengukuran sampel,dimana 1 ml sampel gula yang tidak berwarna dimasukkan dalam tabung reaksi. Lalu ditambahkan 1 ml reagen Nelson yang berwarna biru, dan larutan berubah warna menjadi biru kehijauan (++). Fungsi dari reagen Nelson yaitu untuk mereduksi kupri oksida menjadi kupro oksida. Lalu larutan tersebut dipanaskan dalam air yang mendidih selama 20 menit. Hal ini bertujuan untuk mempercepat proses reduksi kupri oksida menjadi kupro oksida. Lalu larutan didinginkan supaya reaksi berjalan stabil karena jika terlalu panas kemungkinan akan ada komponen senyawa yang rusak atau habis karena menguap. Larutan berubah warna menjadi hijau setelah proses pemanasan tersebut. Setelah didinginkan maka larutan ditambahkan dengan reagen arsenomolybdat yang berwarna kuning kehijauan sebanyak 1mL. Penambahan larutan arsenomolybdat ini bertujuan agar bisa bereaksi dengan endapan kupro oksida. Pada peristiwa ini kupro oksida akan mereduksi kembali arsenomolybdat menjadi molibdene blue yang berwarna biru, warna biru inilah yang nantinya akan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer. Lalu ditambahkan dengan aquadest hingga 10 mL agar larutan tidak terlalu pekat dan dapat terbaca saat dilakukan pembacaan absorbansi. Setelah itu larutan dikocok agar larutan tercampur secara merata dan homogen. Kemudian dilakukan pembacaan absorbansi pada panjang gelombang 540 nm karena pada panjang gelombang ini molekul glukosa dapat menyerap sinar secara optimum sehingga pembacaan absorbansi dapat berjalan dengan baik.
